分肽段（酶解蛋白，常規(guī)蛋白組）與完整蛋白（Intact protein，生物制藥）兩套場景，包含樣品前處理、液相、質譜參數(shù)、儀器狀態(tài)、污染防控、數(shù)據(jù)處理關鍵點Thermo Fis...。

Q Exactive Plus Orbitrap 關鍵硬件：m/z 上限 2000；開啟 EMR 擴展質量模式可達 4000；m/z200 處最高分辨率140?000；HCD 碎裂；無 CID；不適合超大蛋白復合體 native MS清華大學蛋...。

一、樣品前處理通用紅線（肽段 + 完整蛋白）

禁止帶入物質

1：磷酸鹽、硼酸鹽、Tris、HEPES 等難揮發(fā)緩沖鹽；SDS、Triton、NP?40 等非離子 / 離子去污劑；TFA 高濃度、三乙胺、DTT/β?ME 高殘留；甘油、蔗糖、PEG。

鹽、去污劑會強烈抑制電離、產生大量加合物、污染離子源、C?trap、四極桿，嚴重降低儀器壽命Thermo Fis...。

允許緩沖體系：僅甲酸、乙酸、甲酸銨、乙酸銨。

2：耗材：使用低吸附 LoBind 管，普通塑料管會吸附蛋白 / 肽段造成嚴重損失；避免反復凍融；?80℃保存，干冰轉運Thermo Fis...。

3：脫鹽

       酶解肽段：C18 StageTip 脫鹽；

       完整蛋白：Zeba 脫鹽柱、P?6/P?30 凝膠過濾、透析；必須脫鹽后上機Thermo Fis...。

1）酶解肽段（常規(guī)蛋白組，nano?LC?MS/MS）

• 蛋白酶：優(yōu)先 Trypsin；其他酶（Lys?C、Chymotrypsin）確認無自溶污染；酶充分去除。

• 復溶溶劑：0.1% 甲酸水溶液；肽段建議 0.2?1?μg/μL，上樣量 1?2?μg，不宜過高，避免柱過載、離子源快速污染。

• 禁止高濃度 DTT/IAA 殘留；烷基化充分；盡量去除尿素。

2）完整蛋白 Intact（如抗體、重組蛋白，需要 Biopharma 選項）

1. 緩沖液置換為20?50?mM 乙酸銨，pH 6?7，盡量不加酸；完整蛋白不宜高甲酸，易引發(fā)蛋白解折疊。

2. 濃度一般 0.5?5?μM；濃度太高會源內聚集、污染源。

3. 分子量 > 60?kDa，務必打開EMR 擴展質量范圍（m/z 200?4000），否則會丟失高 m/z 多電荷離子信號Thermo Fis...。

4. 抗體還原輕重鏈分析，樣品處理后去除還原劑。

二、液相系統(tǒng)注意事項

納流液相（蛋白組肽段）

• 色譜柱：PepMap C18 trap + 分析柱；柱溫 40?45?℃；流速 300?nL/min。

• 流動相 A：水 + 0.1% 甲酸；B：80% 乙腈?水 + 0.1% 甲酸；乙腈必須 LC?MS 級。

• 梯度：常規(guī) 60?120?min 梯度；梯度結束必須 90% B 強沖洗 15?20?min，再回平衡；蛋白樣品做完必須充分洗柱，蛋白殘留極易累積PMC。

• 樣品瓶：低吸附進樣瓶；避免塑料析出。

完整蛋白液相

• 用適合完整蛋白的 C4 色譜柱，不要用 C18 短肽柱；蛋白容易不可逆吸附在 C18 上。

• 梯度要溫和，乙腈爬升速率放緩；避免強洗脫長時間沖洗。

三、質譜采集參數(shù)要點

① 酶解肽段 DDA（TopN）

1. 離子源（Easy?Spray）：噴霧電壓 2000?2400?V；加熱毛細管 275?℃；S?lens RF 50；鞘氣 / 輔助氣 0（納流）。

2. Full?MS（一級）：

• 分辨率 70?000 @ m/z200；m/z 375?1500；

• AGC target 3e6；Max IT 20?50?ms；profile 模式；

3. dd?MS2 二級：

• 分辨率 17?500 @ m/z200；

• 隔離窗口 1.2?Th；NCE 27?28；固定 first mass 100?m/z；

• AGC 1e5；Max IT 45?100?ms；動態(tài)排除 20?40?s；

• 肽匹配 peptide match：Preferred；同位素排除開啟；

• Top 10?20；排除電荷 + 1、>+6 離子。

注意：Q Exactive Plus 掃描速率上限～12?Hz，梯度時間縮短時要降低 TopN，避免二級堆積。

② 完整蛋白 Intact?MS（EMR 模式）

1. 開啟 Protein mode + EMR（m/z 200?4000）。

2. Full MS 分辨率 70?000?140?000 @ m/z200；AGC target 降低（5e5?1e6），蛋白離子電荷高，容易充過載；Max Injection Time 拉長（200?500?ms）。

3. 源條件偏溫和：毛細管溫度不要過高，防止源內蛋白解離 / 降解；不建議做深度 HCD 碎裂完整大分子；若做亞基碎裂 NCE 15?25，從小值開始摸條件Thermo Fis...。

   
   

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四、上機前儀器狀態(tài)檢查

1. 質量校準：建議每日外標校準；Lock mass 鎖定質量建議開啟，保證質量精度 < 3?ppm（外標），<1?ppm（內標），蛋白 / 肽段鑒定質量容錯依賴此條件Thermo Fis...。

2. 檢查噴霧：納流模式看噴針，無持續(xù)大液滴；噴霧不穩(wěn)定直接報廢整批蛋白樣品。

3. 背景檢查：運行空白梯度，觀察背景是否有高分子蛋白殘留峰；若背景高，先做源、色譜柱沖洗。

4. 測試標準品：酶解 BSA 肽段校驗鑒定數(shù)；完整蛋白可用 BSA 標準品校驗 EMR 模式。

五、污染與維護重點（蛋白測試最容易踩坑）

1. 蛋白極易黏附在離子源、毛細管、錐孔、C?trap。連續(xù)做蛋白樣品，每幾針插空白梯度沖洗；高濃度樣品之后必須洗源。

2. 現(xiàn)象：基線抬升、信號快速衰減、出現(xiàn)寬鼓包峰、加合物大量出現(xiàn)。

3. 處理：

• 納流噴針：定期更換；蛋白殘留噴針噴霧會惡化。

• 離子源組件：毛細管、S?lens 要定期拆卸清洗；蛋白樣品多的周期，清洗頻率高于小分子。

• trap 柱、分析柱：蛋白殘留不可逆，過載后柱子壽命急劇縮短；嚴禁上未脫鹽、含去污劑樣品，會直接廢掉色譜柱。

4. 避免交叉污染：高低濃度樣品之間插入空白進樣；進樣針充分清洗。

六、數(shù)據(jù)處理注意

1. Proteome Discoverer / MaxQuant 參數(shù)：

• 前體質量容忍：±5?ppm 以內；碎片質量容忍 ±0.02?Da；

• 完整蛋白用 Biopharma 軟件套件進行去卷積處理；QE?Plus EMR 模式下抗體去卷積質量準確度約幾十 ppm 級別，不要用肽段的 ppm 要求套用完整蛋白。

2. 注意修飾位點鑒定（脫酰胺、氧化）需要足夠一級分辨率，低分辨會發(fā)生同位素峰重疊錯配PMC。

七、該儀器的固有局限

1. 無 CID，只有 HCD；對某些大肽 / 完整蛋白碎裂效果有限；

2. 原生非共價蛋白復合體（native MS）不適合 Q Exactive Plus，需要專用高 m/z 軌道阱；

3. EMR 模式開啟后，分辨率會有損失，m/z>3000 分辨明顯下降。